张毅敏， 谭天伟
(北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029)
摘 要：采用寡聚环糊精键合凝胶柱分离纯化金银花中的绿原酸，考察了流动相、柱温、负载量及介质再生等因素对分离纯化效果的影响. 分别用脲和十二烷基磺酸钠掩盖氢键和疏水作用，探讨了分离机理. 结果表明，以水:乙醇:醋酸体积比为85:10:5 的混合溶液，负载量为0.5 mg/mL 进行等度洗脱，常温下通过一次色谱即可分离纯化绿原酸，其收率和纯度分别达到65%和97%以上. 介质使用10 次后需要再生，先后经0.3 mol/L NaOH、水和30%乙酸简单再生即可重复利用.
关键词：环糊精；金银花提取物；绿原酸；分离纯化
1 前言
金银花为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)、红腺忍冬(Lonicera hypoglauca Miq.)或山银花(Lonicera dasystyla confusa DC.)的干燥花蕾或初开的花，其含有的药物有效成分主要为绿原酸类化合物，另外还含有黄酮类、三萜皂苷类和挥发油等[1−3]. 金银花的绿原酸提取物具有清热解毒、散风消肿的功能，用于治疗外感风热、流行性感冒、疖疮痛肿诸病[4,5]. 绿原酸可以作为粉针、针剂、注射剂的医药原料[6].
绿原酸(Chlorogenic Acid, CHA) 是由咖啡酸(Caffeic acid)与奎尼酸(Quinic acid)生成的缩酚酯，为苯丙素类化合物. 目前从植物中发现的绿原酸异构体有7 种，其中绿原酸和异绿原酸(Isochlorogenic Acid, ICHA) C 含量较高[7]. 绿原酸是众多抗菌解毒、消炎利胆药材的主要有效成分，常被用作药物定性或定量指标[8]. 绿原酸和异绿原酸C 的分子结构式见图1.
目前常见的绿原酸精制方法主要是柱层析法. 高春荣等[9]采用D101 型大孔树脂分离纯化了金银花中的绿原酸，所得绿原酸纯度和提取率分别为85%和65.12%，大孔吸附树脂对绿原酸的吸附率相对偏低. 徐涛等[10]将金银花水提物通过亲脂性吸附树脂和葡聚糖凝胶Sephadex LH-20 进行分离纯化，所得绿原酸纯度大于98%. 该方法操作繁琐，纯化时间长，对设备要求较高.
以交联琼脂糖凝胶为基体、β-环糊精(β-CD)为配基的新型环糊精键合相具有特异性吸附的显著优点，特别适用于分离中药有效成分. 葛根黄酮中的葛根素[11,12]、茶多酚中的表没食子儿茶素[13]、银杏黄酮水解液中的槲皮素、山奈酚和异鼠李素[14]、丹参中的丹参素[15]、虎杖中的虎杖苷和白藜芦醇[16]等均可采用该方法得到有效纯化，但还未见采用该方法对苯丙素类物质进行纯化的报道.
本研究提出了采用寡聚环糊精键合凝胶介质一步纯化金银花中绿原酸的新方法，考察了流动相和柱温等分离条件，研究了色谱柱的负载量和再生条件，并探讨了色谱分离过程中的作用机理.
2 实验
2.1 材料和仪器
乙醇、甲醇、醋酸、氢氧化钠、硝酸铵、磷酸、脲(Urea)、十二烷基磺酸钠(Sodium Dodecyl Sulfonate, SDS)均为分析纯(北京化工厂)，绿原酸粗品(金银花、杜仲、紫锥菊)购于湖南长沙九汇现代中药有限公司，绿原酸对照品(纯度>98%)购于中国生物制品药品检验所.色谱填充柱β-CD 低聚物偶联Sepharose HP(瑞典Uppsala 大学Janson 教授提供)，恒流泵LP-20C(卫星制造厂北京星达公司)，8823A 紫外检测器(北京新技术应用研究所)，N2000 色谱工作站(浙江大学)，七通进样阀(瑞典Uppsala 惠赠)，岛津10A VP 高效液相色谱(日本岛津公司)，Quattro Premier XE 串联四级杆电喷雾质谱仪(美国Waters 公司).
2.2 实验方法
2.2.1 分离介质的制备方法
β-CD 键合固定相制备方法如下[17]：步为凝胶的活化. 先用蒸馏水洗涤Sepharose HP，然后将蒸馏水、Sepharose HP 和50% NaOH 溶液加入反应瓶控温搅拌.向反应瓶中缓慢流加环氧氯丙烷，并加入醋酸调节pH，最后用蒸馏水洗涤凝胶，即可得到经环氧氯丙烷活化的Sepharose HP；第二步为偶联β-CD. 将蒸馏水、已活化的凝胶、β-CD、50% NaOH 和NaBH4 加入反应瓶中控温搅拌进行偶联反应，并用醋酸调节pH. 反应结束后，用少量蒸馏水洗涤除去不溶反应物，即得到β-CD 低聚物偶联Sepharose HP.
2.2.2 制备色谱样品的准备
将50 mg 绿原酸粗品溶解于5 mL 流动相中配制成10 mg/mL 的溶液，用0.45 μm 微孔滤膜过滤并将澄清溶液通过七通阀进样.
2.2.3 样品分离纯化
在等梯度吸附色谱模式下从绿原酸粗品中分离纯化绿原酸，通过改变流动相组成和配比，确定制备色谱分离流动相，流动相流速为1.0 mL/min，进样量为1 mL.紫外检测吸收波长为280 nm ， 色谱固定相为Oligo-β-cyclodextrin coupled Sepharose HP，柱管为玻璃材质，柱体积22 mL.
2.2.4 绿原酸的分离度、收率和纯化倍数计算方法
分离效果以分离度R 表示. 分离度是衡量混合物两组分在色谱柱中分离效果的指标，计算公式如下：
R=2(t2−t1)/(W1+W2), (1)
式中，t1, t2 为组分1 和组分2 的保留时间(min), W1, W2为组分1 和组分2 的色谱峰两边转折点所划切线与基线相交点之间的截距.
绿原酸粗提物溶液上样后，用流动相进行洗脱，收集的绿原酸洗脱液经真空浓缩和真空干燥得到纯化的绿原酸产品，产品中绿原酸的百分含量即为其纯度，绿原酸收率Y 和纯化倍数T 的计算公式如下：
Y(%)=C1M1/(C0M0)×100%, (2)
T=C1/C0, (3)
式中，C1 为纯化后产品中绿原酸含量(mg/mg)，M1 为纯化后绿原酸产品质量(mg)，C0 为纯化前绿原酸粗提物中绿原酸含量(mg/mg)，M0 为绿原酸粗提物质量(mg).
2.2.5 高效液相色谱分析方法
流动相为含1%磷酸的乙腈水溶液(乙腈:水体积比10:90)，流速1.0 mL/min，进样体积20 μL，紫外检测吸收波长325 nm，色谱柱为Kromasil C18 柱(150 mm×3.9mm, 5 μm).
3 结果与讨论
3.1 流动相对分离效果的影响
绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，其分子结构中含有酯键、不饱和双键及多元酚3 种不同官能团[18]，研究中首先选择乙酸−水和乙醇−水2 种不同体系考察流动相对分离效果的影响.
由研究结果可知，使用5%~40%(ϕ)的乙酸水溶液对绿原酸没有明显的分离效果. 乙醇−水体系乙醇为10%(ϕ)时就能将绿原酸和其他组分分离，随乙醇浓度增加，绿原酸保留时间缩短，同时峰展宽缩小，但当乙醇增加到30%(ϕ)时，绿原酸和前一个杂质峰的分离度迅速下降到0.4. 因此，流动相中的乙醇浓度应维持在相对较低的水平.
进一步研究发现，乙醇−水体系中加少量乙酸可达到兼顾分离度和保留时间的目的. 选择不同体积比的水−乙醇−乙酸混合溶液为流动相，分段收集绿原酸流出液.图2 为乙醇:乙酸:水体积比为10:5:85 的三相体系为流动相的绿原酸的色谱分离图，图中标示的主吸收峰为绿原酸.
3.2 柱温对分离效果的影响
在0.5 mg/mL(湿凝胶，下同)的负载量下，分别在不同温度下进行色谱分离，考察温度与绿原酸保留时间的关系，结果如表1 所示. 在10~35℃温度下保留时间变化不大. 10 ℃时进行色谱分离，绿原酸的分离度为1.011，分离效果. 随温度升高，分离度下降，35℃
时绿原酸的分离度降低到0.588. 这是由于在绿原酸的分离过程中，分子间氢键是比较主要的
作用力. 氢键对温度敏感，所以温度改变对绿原酸分离度影响很大.
3.3 柱负载量的测定
取进样量为1~50 mg，对不同的进样量分别计算目标产品绿原酸和相邻前一杂质的分离度(绿原酸与相邻后一杂质均为基线分离，故不予考虑)，结果如图3 所示. 从图可以看出，在0.5 mg/mL 的高负载量时，绿原酸的分离度在0.50 左右，纯度保持在80%左右.
3.4 绿原酸样品的质谱鉴定
对制备的绿原酸样品进行质谱鉴定和分析，方法见文献[19]. 收集制备的绿原酸样品在Waters Quattro Premier XE 串联四极杆质谱仪上进行电喷雾质谱(ESI-MS/MS)鉴定，结果如图4 所示，其中峰353.1 为绿原酸的分子离子峰，峰375.2 为结合了一分子钠的绿原酸的负离子的质谱峰.
与标准品对照发现，所制样品同标准品的质谱较一致，表明所制样品为绿原酸，且杂质很少. 通过质谱检测可知，金银花的绿原酸提取物经寡聚环糊精键合的凝胶介质纯化后，各种成分得到了有效分离，可以制得高纯度绿原酸. 图5 是绿原酸在质谱中被轰击后的裂解过程示意图. 绿原酸受到轰击后，裂解成为咖啡酸的正离子状态和奎尼酸的负离子状态. 裂解过程有2 个途径，一个是绿原酸的负离子直接裂解为咖啡酸的正离子状态和奎尼酸的负离子状态，另一个是结合了1 分子钠的绿原酸的负离子裂解为咖啡酸和奎尼酸.
3.5 绿原酸收率和纯度的关系
在0.5 mg/mL 的负载量下，分别采用不同体积比(80:20:0, 90:10:0, 85:10:5, 95:0:5, 90:0:10)的水−乙醇−乙酸三相体系作为流动相，分段收集绿原酸流出液，采用HPLC 外标法计算得到收集液中绿原酸的收率和纯度，二者的关系如图6 所示.
研究结果表明， 使用寡聚环糊精配基键合的Sepharose HP 介质从金银花的绿原酸提取物中精制绿原酸时，使用体积比为85:10:5 的水−乙醇−乙酸三相体系分离效果，仅经过一次色谱分离，纯度就能达到97%，此时的收率保持在65%以上，优于大孔吸附树脂法所得绿原酸(纯度85%，收率65.12%). 与亲脂性吸附树脂和葡聚糖凝胶Sephadex LH-20 法比较，在绿原酸纯度相同的情况下，本研究方法操作简单、收率较高.
3.6 寡聚环糊精键合凝胶柱的再生
经过多次制备分离后，样品中各组分在凝胶介质上的分离度会明显下降，如表2 所示. 色谱柱使用10 次后色谱分离度还保持在0.7 以上，绿原酸保持较好的分离效果，当色谱柱使用11 次时，分离度降低到0.662，需要再生. 分别用丙酮、甲醇、乙醇、乙酸水溶液和NaOH水溶液对色谱柱进行再生，结果表明单一的溶剂再生效果均不理想. 因此选择多种溶剂对介质进行再生，发现先后用1 倍柱体积的0.3 mol/L NaOH、水和30%乙酸清洗后介质即可再生. 再生后色谱柱对绿原酸的分离度达到1.208，分离效果很好.
3.7 金银花、杜仲、紫锥菊中绿原酸的分离纯化
为了考察本研究方法对不同药材中绿原酸的分离效果，选取金银花、杜仲、紫锥菊3 种药材的绿原酸粗提物，分别进行了绿原酸的分离纯化，得到绿原酸的精制产品，结果如表3 所示. 由表可以看出，本研究方法得到的3 种药材的绿原酸分离度均达到0.96 以上. 精制
后金银花中绿原酸产品纯度达97%，纯化倍数达3.9，紫锥菊中绿原酸的纯化倍数最高，达6.54，这可能与紫锥菊的粗提物本身绿原酸的含量很低有关.
3.8 分离机理
绿原酸类物质是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，其分子结构中有疏水性的母核和亲水性的侧链基团—羟基.绿原酸类化合物能与环糊精配基同时发生氢键作用和疏水作用，从而为色谱分离过程提供保留作用力[20]. 在优化后的流动相中添加脲和十二烷基磺酸钠(SDS)，以分别掩盖色谱分离过程中的氢键和疏水作用，进而探讨了绿原酸的分离机理，结果如图7 所示.
由图7(a)可见，在流动相中添加10%脲后，绿原酸的保留时间由50 min 降为40 min，且前一杂质的色谱峰消失，绿原酸和前一杂质的分离度从1.208 下降到0，这表明氢键在绿原酸的分离过程中起了十分重要的作用，与温度对绿原酸的分离影响一致. 由图7(b)可以看出，添加2% SDS 后，绿原酸的保留时间同样由50 min降为40 min，绿原酸和前一杂质的分离度下降到0.40，这表明疏水作用同样对绿原酸的分离纯化有重要影响.
4 结论
寡聚环糊精键合凝胶柱能纯化金银花中的绿原酸，流动相、柱温、负载量及介质再生等因素对分离纯化效果有重要影响，本研究得到如下结论：
(1) 采用寡聚环糊精配基键合的Sepharose HP 凝胶介质可以从绿原酸粗品中分离纯化绿原酸. 确定的流动相为乙醇−乙酸−水(体积比为10:5:85)三相体系.
(2) 介质的负载量为0.5 mg/mL 时，仅通过一次色谱分离纯化，绿原酸的纯度即可达97%，收率为65%.
(3) 色谱柱使用10 次后需要再生，分别使用1 倍柱体积的0.3 mol/L NaOH 溶液、水、30%乙酸清洗即可使介质再生，再生后色谱柱的分离能力可恢复.
(4) 通过研究证实了分离过程中氢键和疏水作用同时存在，且都对绿原酸的分离有影响.
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